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生化分析仪

生化试剂的基本知识

文章出处:网责任编辑:作者:人气:-发表时间:2017-12-26 09:31:00

一、生化试剂的分类

(一)按照化学性质分类

1. 酶类:包括ALT,AST,ALP,ACP,r-GT,α-HBDH,LDH,CK,CK-MB,α-AMY,MSO,ADA,ChE等。

2.底物/代谢产物类:包括TG,TC,HDL-C,LDL-C,UA,UREA,Cr,Glu,TP,Alb,T-Bil,TBA,NH4+,CO2等。

3.无机离子类:包括Ca,P,Mg,Cl等。

4.特种蛋白类:包括apoAl,apoB,Lp(a),C3,C4,PFB(B因子)IgG,IgA,IgM等。

(二) 按照临床应用分类

1.无机离子:包括CaPMgCl等。

2. 肝功能:包括ALTASTr-GTALPMSOT-BilD-BilTBATPAlb等。

3.肾功能:UAUREACr等。

4.心肌酶谱:CKCK-MBLDH,α-HBDHASTMSO

5. 糖尿病:GLU等。

6.前列腺疾病:ACPp-ACP等。

7.胰腺炎:α-AMY

8.血脂:TCTGHDL-CLDL-CapoA1apoBLp(a)

9.痛风:UA

10.有机磷中毒:ChE

11.免疫性疾病:C3C4PFB(B因子)IgGIgAIgMKappa链,Lambda链。

二、反应速度特性

按照反应速度,可以分为终点法试剂和动力学试剂。而动力学试剂又可再分为零级动力学法和一级动力学法。

(一) 终点法试剂

终点法,指经过一段时间(一般为几分钟)的反应,反应进行到完全,使全部底物(被测物)转变成产物,称终点法,更确切地说应称平衡法,这是最理想的分析类型。如图(1)。

整个反应达到平衡,由于正向反应的平衡常数很大,可认为所有的被测定物已转变为产物,反应液的吸光度不再增加(或降低),吸光度的增加(或降低)程度与被测定物的浓度成正比。

终点法对反应条件(如酶量、pH、温度)小的改变不敏感,只要这种改变不影响在一定时间内反应达到平衡即可,是最理想的反应模型。


图(1

属于终点法的试剂主要有:

TGTCHDL-CLDL-CUAGluTPAlbT-BilD-BilCr(氧化酶法),NH4+CO2 CaPMgCl apoA1apoBLp(a)C3C4PFB(B因子)IgGIgAIgM等。

(二)动力学法试剂

1.零级动力学法

零级动力学法,指反应过程中反应速度维持不变,达到最大,与底物浓度无关,因此,在整个反应过程中,反应物可以匀速地生成某个产物,导致被测定溶液在某一波长下吸光度均匀地减小或增加,减小或增加的速度(△A/min)与被测物的活性或浓度成正比,主要用于酶活性的测定。如图(2)。

实际上,由于底物浓度不可能足够大,随着反应的进行,底物消耗到一定程度后,反应速度不再维持不变,同样从启动反应到达到最大速度需要一定时间。因此,零级动力学法是针对特定时间而言的,各试剂商对这段时间有严格规定。


图(2

属于零级动力学法的试剂主要有:

ALTASTALPACPr-GT,α-HBDHLDHCKCK-MB,α-AMYMSOADAChETBA等。

2.一级动力学法

在一定的反应时间内,反应速度与底物浓度的一次方成正比,由于底物在不断的消耗,因此整个反应的速度在不断的减少,表现为吸光度的增加(或降低)速度越来越小,这类反应达到平衡的时间很长,理论上可以在任意时间段进行监测,但由于血清成份复杂,反应刚启动时反应较复杂,杂反应较多,经过一段延迟时间才能进入稳定反应期,必需在特定时间段内进行监测,各试剂商对这段时间有严格规定。如图(3)。

在一固定时间间隔中,底物浓度的变化量正比于底物的初浓度,这是一级反应的同性。该段时间内吸光度的增加或降低与被测物的浓度成正比。

图(3

属于一级动力学法的试剂主要有:

Cr(苦味酸法),UREA(紫外监测法)

三、显色原理

显色系统主要有以下几种:

?  NAD-NADHNADP-NADPH系统

?  p-NPp-NA系统

?  H2O2偶联的指示系统

?  抗原抗体反应指示系统

?  其它显色反应

(一)  NAD-NADHNADP-NADPH系统

NADHNADPH340nm有特征性吸收峰,而NADNADP340nm无特征性吸收峰,利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应,根据340nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性。

作为该指示系统常用的工具酶有LDHMDHGLDHG6PDH

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有:ALTASTCKLDHCK-MB、α-HBDH GluUREANH4+ CO2等。

(二)  p-NPp-NA系统

p-NPp-NA405nm有特征性吸收峰,根据405nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALPACPr-GTAMY等。

(三)  H2O2偶联的指示系统

H2O2在过氧化物酶的作用下,可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素,导致某一波长吸光度的增加,因此可用来测定物质的浓度或活性

用于此指示系统的单一色素原有TMBABTS等;成对色素原有酚和4AAMBTHDMA等。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有TCTGHDL-CLDL-CGluCrUA等。

(四)  抗原抗体反应指示系统

特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物,形成一定的浊度,导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下,改变程度与抗原浓度成正比。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAIapoBLp(a)IgGIgAIgMC3C4CRP等。

(五)其它显色反应

蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物,在一定浓度范围内颜色反应强度与蛋白质的浓度成正比。用于TP的测定。

溴甲酚绿(BCG)在非离子去污剂Brij35的存在下,可与白蛋白形成紧密结合的绿色复合物。用于Alb的测定。

重氮苯磺酸盐与胆红素生成红紫色偶氮胆红素。用于总胆红素和直接胆红素的测定。

甲基麝香草酚兰(MTB)在碱性条件下可与CaMg形成有色络合物。用于CaMg的测定。

四、性能评价方法

(一)主要性能指标:

1.稳定性:指在规定条件下经过一段时间的保存,仍能达到相应的性能指标,如试剂空白吸光度、线性范围、灵敏度等。

2.反应灵敏度:指单位浓度(或活性)的测定物反应所产生的反应度,反应度越高,灵敏度越大。

3.精密度:结果间相互符合的一致程度

4.准确度:与参考测定程序结果的一致性

5.线性范围:在规定的重复性和线性偏差下,测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。

6.基质效应:基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰,并影响分析结果的准确性。例如,溶液的离子强度会对分析物活度系数有影响,这些影响和干扰被称为基质效应(matrix effect)。

7.抗干扰性:

8.其它:试剂/样本比例、反应时间、价格等。

(二)性能评价方法

1. 稳定性:连续观测,每日试验;热加速试验。

2.反应灵敏度:直接计算单位浓度反应物的吸光度变化或变化率。

3. 精密度:按照NCCLS EP5-A进行。

4.准确度:按照NCCLS EP9-A2 进行。

5. 线性范围:按照NCCLS EP6-A 进行。

6.基质效应:通过回收试验确定

7. 抗干扰性:按照NCCLS EP7-A进行。

 


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